الهيكل الثلاثي الأبعاد للبروتيز SARS-CoV-2 الرئيسي. يتكون مركب dimer الجزيئي من مونومر واحد (أخضر) مرتبط بمونومر آخر (وردي) حيث يرتبط مثبط الدواء بتجويف الموقع الحفاز لمنع الفيروس من التكاثر. من حساب : ORNL / أندريه كوفاليفسكي ، جيل هيمان
in ,

تاريخ أبحاث فيروس نقص المناعة البشرية الثاقبة يلهم نهج التشتت النيوتروني لدراسة COVID-19

الهيكل الثلاثي الأبعاد للبروتيز SARS-CoV-2 الرئيسي. يتكون مركب dimer الجزيئي من مونومر واحد (أخضر) مرتبط بمونومر آخر (وردي) حيث يرتبط مثبط الدواء بتجويف الموقع الحفاز لمنع الفيروس من التكاثر. من حساب : ORNL / أندريه كوفاليفسكي ، جيل هيمان

مع استمرار انتشار الفيروس التاجي الجديد ، يبحث الباحثون عن طرق جديدة لوقفه. لكن بالنسبة إلى عالِمين ، فإن التطلع إلى المستقبل يعني الإلهام من الماضي.

في يناير من عام 2020 ، كان أندريه كوفاليفسكي ودانييل نيللر ، الباحثان في مختبر أوك ريدج الوطني التابع لوزارة الطاقة (ORNL) ، يستعدون لاستخدام النيوترونات لدراسة العلاقة بين بروتيز معين لفيروس نقص المناعة البشرية – إنزيم بروتيني يسمح للفيروس لتكرار نفسه داخل جسم الإنسان – وفئة من الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية تعرف باسم مثبطات الأنزيم البروتيني لفيروس نقص المناعة البشرية. بعض أنواع فيروس نقص المناعة البشرية تبني مقاومة لهذه الأدوية. كان هدف الباحثين هو الحصول على فهم أفضل لكيفية عمل اختلافات البروتياز ، للمساعدة في تطوير علاجات متطورة للتغلب على أصعب سلالات فيروس نقص المناعة البشرية المقاومة.

عندما بدأ الفريق عملهم ، لم يعرفوا سوى القليل ، ومن قبيل الصدفة ، أن جهودهم لدراسة فيروس نقص المناعة البشرية ستضعهم بسرعة على مسار جديد لمعالجة COVID-19 ، الوباء الذي أصبح الآن في قبضته.

كما اتضح ، فإن النشاط الأنزيمي البروتيني الذي يمكّن فيروس نقص المناعة البشرية من التكاثر – الآلية نفسها التي كان فريق Kovalevsky يستعد لها للتحقيق مع النيوترونات – هي نفس آلية التكرار التي يستخدمها SARS-CoV-2 ، الفيروس الذي يسبب المرض COVID-19 .

الآن ، حول الفريق تركيز النهج التجريبي الذي ينوون استخدامه لدراسة فيروس نقص المناعة البشرية لمكافحة التهديد العالمي الجديد.

تدور دراسات فيروس نقص المناعة البشرية حول فيروس كورونا الجديد

يدرس كوفاليفسكي فيروس نقص المناعة البشرية منذ 15 عامًا. بصفته مصورًا بلوريًا نيوترونيًا ، يدرس عينات صغيرة مبلورة من المادة البيولوجية عن طريق قصفها بالنيوترونات. إن تقنية الانتثار النيوتروني فعالة للغاية في الكشف عن كيفية ترتيب البنية الذرية للعينة وكيف تتصرف ذراتها. اعتمادًا على الهدف ، يمكن أن توفر الرؤى التي تم جمعها إرشادات حول كيفية تحسين أو حتى قمع خصائص معينة للمادة البيولوجية.

النيوترونات هي أداة مثالية لدراسة الهياكل والسلوكيات البيولوجية بسبب حساسيتها الحادة لعناصر الضوء مثل الهيدروجين وقدرتها على استكشاف هذه المواد دون الإضرار بها.

في عام 2019 ، شرع كوفاليفسكي في دراسة فيروس نقص المناعة البشرية بطريقة لم يتم إجراؤها من قبل. سيسمح له استخدام الانتثار النيوتروني غير المرن بجمع بيانات عن ديناميات ، أو حركات بروتياز فيروس نقص المناعة البشرية ، مما سيضيف إلى بيانات حيود النيوترونات التي كان يجمعها لسنوات. إن امتلاك المعلومات الهيكلية والسلوكية – أو الديناميكية – سيوفر صورة أكثر اكتمالاً لكيفية عمل الفيروس ، وقد يؤدي بدوره إلى تقدم جديد في العلاجات.

بعد استخدام مطياف الرؤية في مصدر ORNL Spallation Neutron Source (SNS) – أداة تشتت النيوترون تكشف حركات الذرات بناءً على اهتزازاتها – أدرك كوفاليفسكي أنه بحاجة إلى مساعدة في تحليل البيانات.

وأوضح كوفاليفسكي في جلب نيللر: “يجلب دانيال خبرة في أبحاث البروتياز الفيروسي”. “إنه يعرف كيفية العمل مع البروتينات الموجودة في المختبر. إنه يعرف جميع تقنيات المختبر من حيث إنتاج البروتين وتنقيته وبلورته وجمع البيانات البلورية وتحليله للحصول على رؤى حول تصميم الأدوية.”

يقول كوفاليفسكي إن الأمر استغرق حوالي 8 أشهر لتوظيف دانيال بعد بحث شامل. انضم نيللر – المتخصص في دراسة بروتيز فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام علم البلورات – إلى فريق كوفاليفسكي في يناير من عام 2020 للمساعدة في العمل التجريبي والحسابي على بروتيز فيروس نقص المناعة البشرية.

ولكن مثلما كان الفريق جاهزًا للتعمق ، أصبح COVID-19 عالميًا ، وتوقف البحث بشدة.

يستخدم الباحث ما بعد الدكتوراه دانيال نيللر مركز ORNL للبيولوجيا الإنشائية والجزيئية لتجميع البروتينات المتبلورة المتعلقة بـ COVID-19 وإعدادها لدراسات التشتت النيوتروني في Spallation Neutron Source و High Flux Isotope Reactor. الصورة من حساب : ORNL / كارلوس جونز

تبديل التروس والحصول على نتائج مبكرة

في مارس ، طور طاقم العاملين في Neutron Sciences في ORNL خطة لدراسة المكونات الرئيسية لـ COVID-19 من خلال تجميع فرق البحث وإعادة ترتيب أولويات جداول تشغيل الأدوات الأساسية في منشتي الانتثار النيوتروني في ORNL و SNS ومفاعل نظائر عالية التدفق (HFIR) .

بعد أن وضع بالفعل الأساس لدراسة البروتياز ، انتقل كوفاليفيسكي و نيللر على الفور من فيروس نقص المناعة البشرية إلى فيروس كورونا الجديد. على وجه التحديد ، يركزون حاليًا على البروتيز الرئيسي لـ SARS-CoV-2 ، الفيروس الذي يسبب مرض COVID-19.

وقال “إن بروتيز سارز – CoV – 2 هو إنزيم يقطع البروتينات التي تمكن الفيروس من التكاثر. إن فهم كيفية تجميع البروتيز وكيف يعمل هو خطوة أولى حاسمة للعثور على مثبطات دواء فعالة لمنع آلية تكرار الفيروس”. كوفاليفسكي. “على غرار بروتياز فيروس نقص المناعة البشرية ، فإن البروتياز الرئيسي من فيروس السارس – CoV – 2 هو واحد من أكثر أهداف المخدرات جاذبية في الوقت الحالي لتصميم مثبطات محددة.”

كما هو الحال مع الخطة الأصلية لعمل فيروس نقص المناعة البشرية ، يستعد الفريق لاستخدام الأدوات في SNS و HFIR للحصول على رؤى أساسية حول كيفية ترتيب الذرات في البروتياز. باستخدام أدوات MaNDi و IMAGINE ، سيتمكن الباحثون من تجميع البنية الذرية للبروتياز باستخدام النيوترونات لتتبع ذرات الهيدروجين داخل عينات البروتين المتبلور.

لكن أولاً ، يجب عليهم الحصول على بلورات عالية الجودة كبيرة بما يكفي للتجارب النيوترونية. هذا هو المكان الذي قطع فيه الفريق خطوات كبيرة في وقت مبكر.

يتم تحديد جودة البلورة أولاً من خلال مدى تشتتها أو تشتتها بالأشعة السينية. عادة ، يتم إجراء هذه العملية في منشأة السنكروترون ، حيث يمكن تجميد البلورات إلى حوالي 100 كلفن (أو حوالي -280 درجة فهرنهايت).

استخدم الفريق مختبر تبلور البروتين وتوصيفه في SNS لتنمية بلورات السارس COV-2 التي استغرقت حوالي أسبوع إلى 10 أيام. لتحليل جودة البلورات ، استخدموا آلة الأشعة السينية المحلية ، Rigaku HighFlux HomeLab ، والتي قدمت العديد من النتائج الرئيسية.

أولاً ، أكدت تجارب الأشعة السينية أن البلورات ذات جودة عالية وأن الطريقة المستخدمة لزراعتها قد تنتج بلورات أكبر مناسبة لتجارب النيوترونات. ثانيًا ، سمح لهم وجود آلة محلية بجمع قياسات الأشعة السينية في درجة حرارة الغرفة ، حوالي 70 درجة فهرنهايت.

مكنتهم قياسات درجة حرارة الغرفة من ملاحظة اللدونة ، أو المرونة لبنية البروتياز ، وتوفير معلومات يمكن التعرف عليها حول كيفية تصرف الهيكل في ظروف قريبة من البيئة الفسيولوجية للفيروس. لا يمكن الحصول على هذه البيانات باستخدام عينات مجمدة.

قال نيللر: “هذا معلم هام في جهودنا للقيام بالحيود النيوتروني. لقد حقق الاستثمار في آلة الأشعة السينية المحلية نتائج جيدة”. “في إحدى الحالات ، قمنا بتنمية البلورات يوم الاثنين وجمعنا بيانات عنها يوم الثلاثاء. وإلا  للحصول على هذه المعلومات ، سيكون عليك إرسال بلوراتك إلى سنكروترون ، الأمر الذي قد يستغرق أيامًا إلى أسابيع.”

وأضاف كوفاليفسكي: “وفي الوقت الحالي ، بسبب الوباء ، لا يمكنك الذهاب إلى سينكروترون”. “ولتحليل البلورات في درجة حرارة الغرفة ، يجب أن تكون هناك.”

“إن المعلومات التي تعلمناها من هيكل درجة حرارة الغرفة لديها القدرة على التأثير على الفور في الاتجاهات الحسابية التي يستخدمها الباحثون. لقد وجدنا بعض الاختلافات بين البنية الفسيولوجية القريبة من درجة حرارة الغرفة والهياكل المجمدة من السنكروترونات ، والتي قد تكون مهمة بالنسبة وقال نيللر “إن العمليات الحسابية ، مثل دراسات إرساء الجزيئات الصغيرة التي يتم إجراؤها في قمة الحاسبات العملاقة لشركة ORNL”.

منظر مجهري لبلورات بروتيز SARS-CoV-2 المزروعة في مختبر بلورة البروتين وتوصيفه في ORNL. بمجرد أن تصل البلورات إلى حجم وشكل معين ، سيتم استخدامها في تجارب التشتت النيوتروني لتحديد كيفية هيكلة بروتيز SARS-CoV-2 الرئيسي وكيف يتصرف. الصورة من حساب : ORNL / دانييل نيلر

“حتى الآن ، لقد حققنا نجاحًا كبيرًا في دراساتنا المبكرة حول COVID-19. لقد قدمنا بالفعل مخطوطة للنشر حول النتائج الهيكلية التي أجريناها ، والتي أجرينا فيها في الأساس شهرين من البحث الذي قد يستغرق عادةً عام.”

ساعد كوفاليسكي و نيللر في تحليل البيانات وبنية بلورات البروتين Leighton Coates ، وهو عالم أدوات في مقياس الانكسار SNS MaNDi وهو أيضًا عضو في فريق علم البلورات الذي يدرس السارس البروتيني SARS-CoV-2.

ستتم مشاركة البيانات التي تم إنشاؤها على مدى الأشهر القليلة القادمة مع المختبرات الوطنية الأخرى والجامعات والمجتمع العلمي الأوسع لبناء نماذج أكثر دقة للمحاكاة الحسابية المستخدمة لتحديد مرشحي الأدوية المحتملين لوقف الفيروس.

وقال كوفاليسكي “لقد استجاب المجتمع العلمي بسرعة لوباء COVID-19. نحن محظوظون لأننا قادرون على تقديم مساهماتنا الخاصة من خلال الاستفادة من سنوات من الخبرة في دراسة فيروس نقص المناعة البشرية HIV لبناء فهم أفضل لكيفية تكرار الفيروس التاجي الجديد وكيف يمكننا محاربته من خلال  تثبيط البروتياز الأساسية “.

البحث في مقاومة فيروس نقص المناعة البشرية

قبل أن يحول الوباء انتباههم وجهودهم للبحث في السارس – CoV – 2 ، كان لدى كوفاليفسكي ونيللر خطة واضحة لمهاجمة فيروس نقص المناعة البشرية.

تسعة وثلاثون مليون شخص حول العالم مصابون بفيروس نقص المناعة البشرية HIV . إن تزويد هؤلاء الأشخاص بخيارات علاجية أفضل لن يحسن جودة حياتهم فحسب ، بل سيمنع هذا المرض من الانتشار أكثر.

يعمل البروتياز لفيروس نقص المناعة البشرية HIV عن طريق قطع خيوط غير ضارة ، أو غير وظيفية ، من البروتينات إلى بروتينات أصغر ، وتحويلها إلى بروتينات فيروسية وظيفية تمكن الفيروس من التجمع والاستمرار في إصابة الخلايا البشرية السليمة. بشكل عام ، تكون مثبطات الأنزيم البروتيني لفيروس نقص المناعة البشرية فعالة جدًا في منع البروتياز أثناء تكرار فيروس نقص المناعة البشرية ، ولكن بعض الاختلافات من البروتياز طورت القدرة على مقاومة مثبطات الأدوية.

قال نيللر: “إذا تمكنا من معرفة المزيد عن الآليات الجزيئية التي تجعل المتغيرات البروتينية لفيروس نقص المناعة البشرية مقاومة للأدوية ، فيمكننا تصميم عقاقير مجهزة بشكل أفضل للتغلب على دفاعاتها”.

على وجه التحديد ، أراد كل من نيللر و كوفاليسكي استكشاف PRS-17 ، وهو متغير فريد من نوع فيروس نقص المناعة البشرية الذي يقل احتماله بمقدار 10000 مرة عن المتغيرات غير المقاومة الأخرى التي يتم تثبيتها بواسطة مثبطات الأنزيم البروتيني الأكثر فعالية المتوفرة حاليًا. أوضح كوفاليفسكي أنه في حين أن برامج علاج فيروس نقص المناعة البشرية قد قطعت شوطا طويلا منذ أن بدأ جائحة فيروس نقص المناعة البشرية لأول مرة في الثمانينيات ، فإن المتغيرات المتغيرة مثل PRS-17 ، الناتجة عن العلاج لفترات طويلة ، يمكن أن تعرض سنوات من الابتكار الصيدلاني والتقدم وتؤدي إلى فشل العلاجات المضادة للفيروسات.

“إن مقاومة الأدوية هي الآن أكبر مشكلة لمرضى فيروس نقص المناعة البشرية. من خلال العلاج المناسب ، يمكن للمرضى أن يعيشوا حياة طويلة وسعيدة مع مستويات لا يمكن اكتشافها من فيروس نقص المناعة البشرية في نظامهم. لن يصابوا بالإيدز أو ينقلوا فيروس نقص المناعة البشرية إلى الآخرين.  وقال كوفاليسكي : متغيرات فيروس نقص المناعة البشرية مقاومة للأدوية تجعل من الصعب على الأطباء لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية في مرضاهم “.

يقول الباحثون إنه من الصعب فهم كيفية تحييد PRS-17 فعالية مثبطات الأنزيم البروتيني لفيروس نقص المناعة البشرية. البروتينات المكونة للفيروسات هي أنظمة معقدة ، ولدى PRS-17 القدرة على استخدام العديد من الآليات المختلفة لحماية نفسها من الأدوية المضادة للفيروسات الرجعية.

وأوضح نيللر أن “معرفة كيفية مقاومة PRS-17 لمثبطات الأنزيم البروتيني لفيروس نقص المناعة البشرية يمثل تحديًا ، ولكن يجب علينا التغلب عليه تمامًا. PRS-17 عبارة عن عزلة إكلينيكية ، مما يعني أنها جاءت من مريض فعلي يسعى لمكافحة هذا المرض”. “معرفة المزيد عنه يمكن أن ينقذ حياة العديد من المرضى ، لأن المعرفة التي نكتسبها باستخدام النيوترونات على PRS-17 ستكون قابلة للتحويل إلى متغيرات بروتياز أخرى شديدة المقاومة للأدوية.

نوع مقاوم للأدوية من بروتياز فيروس نقص المناعة البشرية يتفاعل مع مثبط فيروس نقص المناعة البشرية. يأمل كل من نيلر وكوفاليفسكي أن نفس التقنيات التي استخدماها لمعرفة المزيد عن فيروس نقص المناعة البشرية ستساعد أيضًا زملاء الباحثين في معركة COVID-19. الصورة من حساب : ORNL / جيل هيمان

كان الفريق يعتزم إنشاء خريطة للبروتيز PRS-17 لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء مقاومته للأدوية بشكل أفضل. تضمن ذلك استخدام أدوات MaNDi و VISION في SNS وأداة IMAGINE في HFIR.

قال كوفاليفسكي: “لقد كانت نفس الطريقة التي نحاول الآن استخدامها مع COVID-19”.

مع MaNDi و IMAGINE ، كان نيللر و كوفاليفسكي  يخططان لاستقصاء عينات متبلورة من PRS-17 البروتياز لتوليد بيانات تفصيلية عن هيكله الذري الثابت. إن استخدام VISION سيمكنهم من فحص عينات مسحوق PRS-17 من البروتياز لتقديم رؤى حول خصائصه الديناميكية من خلال قياس الاهتزازات الجزيئية.

النيوترونات مناسبة بشكل خاص لدراسة مكونات الفيروسات مثل HIV (أو SARS-CoV-2) بسبب حساسيتها للهيدروجين ، وهو مكون مهم لجميع البروتينات. مع علم البلورات النيوتروني ، يمكن للفريق تحديد موقع كل ذرة هيدروجين بدقة في بروتياز PRS-17 ، مما يمنحهم رؤية غير مسبوقة في كيفية عمل البروتين والتفاعلات التي يخضع لها مع مثبط البروتياز.

قال نيللر: “استخدام البلورات النيوترونية في MaNDi و IMAGINE لتحديد ذرات الهيدروجين في بلورات PRS-17 البروتياز ، سيمكننا من بناء صورة شاملة لهيكله الثابت”. “باستخدام VISION ، سنتتبع أيضًا ذرات الهيدروجين ، ولكننا سنستخدم عينات مسحوق من PRS-17 البروتيز التي أعيد ترطيبها لتقليد الظروف المزدحمة للجسيمات الفيروسية لفيروس نقص المناعة البشرية. سيتيح لنا ذلك رؤية خصائصه الديناميكية ومعرفة المزيد عن كيف يمكن أن تتحرك عندما تعمل داخل جسيم فيروسي “.

وأوضح نيللر أن الحصول على معلومات حول كل من الخصائص الثابتة والديناميكية لـ PRS-17 أمر مهم لتطوير فهم كامل لمقاومة هذا الفيروس للأدوية المضادة للفيروسات الرجعية.

“إذا قمت بتتبع موقعك مرة واحدة فقط في اليوم عند منتصف الليل ، أعتقد أنك ستقضي كل وقتك في المنزل. ولكن في الحقيقة ، أنت تتنقل قليلًا طوال اليوم. ولهذا السبب من المهم جمع القياسات الثابتة والديناميكية لكل من قال عينتنا. إنها تتيح لنا بناء صورة أكثر اكتمالا لسلوك البروتياز “.

وأضاف نيللر: “بدون علم البلورات النيوترونية ، يتعين على الباحثين إجراء تخمينات مدروسة حول مكان ذرات الهيدروجين في البروتين كلما حاولوا فهم كيفية قيام البروتين بعمله”. “هذه الأنواع من التجارب التي أجراها أندري سابقًا تمكنت بالفعل من تأكيد مواقع ذرات الهيدروجين هذه في متغيرات البروتياز غير المقاومة لفيروس نقص المناعة البشرية ، ولكن لم تكن أبدًا في متغير البروتياز المقاوم للأدوية للغاية. وهذا يعني أننا سنكون قادرين على إنتاج فريد وفريد حقًا بيانات جديدة حول هذا البروتياز “.

يأمل كل من نيلر وكوفاليفسكي في توليد البيانات يومًا ما من خلال تجاربهما التي ستصبح موردًا لا يقدر بثمن للباحثين الذين يتطلعون إلى مكافحة سلالات فيروس نقص المناعة البشرية المقاومة للأدوية.

قال نيللر: “إنه جهد جماعي. يتعين على الكيميائيين وعلماء الأحياء والمهنيين من صناعة الأدوية العمل معًا لمكافحة المرض”. “معًا ، يمكننا تطوير علاجات فعالة لسلالات فيروس نقص المناعة البشرية المقاومة للأدوية.”

تم دعم البحث من قبل مكتب وزارة الطاقة للعلوم من خلال المختبر الوطني الافتراضي للتكنولوجيا الحيوية ، وهو اتحاد من المختبرات الوطنية لوزارة الطاقة يركز على الاستجابة لـ COVID-19 ، بتمويل من the Coronavirus CARES Act.

What do you think?

Comments

اترك تعليقاً

لن يتم نشر عنوان بريدك الإلكتروني. الحقول الإلزامية مشار إليها بـ *

Loading…

0

اكتشاف أقدم تقنيات القوس والسهم في أوراسيا

اثنين من مبيدات الآفات المستخدمة تقصر حياة نحل العسل